方案概述
前言：
亞硝胺雜質(zhì)是指一類常見的有機(jī)化合物，其結(jié)構(gòu)中含有一個或多個亞硝基（-NO）基團(tuán)。 亞硝胺雜質(zhì)通常在食品、飲料、藥品以及化妝品等產(chǎn)品中存在。它們是由于食品加工過程中，其中含有的亞硝酸鹽與氨基化合物（如氨基酸和蛋白質(zhì)）反應(yīng)生成的。亞硝胺雜質(zhì)被認(rèn)為具有潛在的致癌和致突變作用，因此對其進(jìn)行監(jiān)測和控制至關(guān)重要。根據(jù)亞硝胺結(jié)構(gòu)可以將亞硝胺分為兩類，一類是小分子亞硝胺如NDMA、NDEA等，另外一類是NDSRIs（藥物成分相關(guān)亞硝胺），其與API結(jié)構(gòu)相似或相關(guān)，由API或其片段中的胺基與物料中亞硝化試劑（如亞硝酸鹽）反應(yīng)生成。
利福平與利福噴丁均為治療結(jié)核最常見的藥物之一，其利福平合成路徑中產(chǎn)生的與API片段相似的1-甲基-4-亞硝基哌嗪（MNP）與利福噴丁合成路徑中產(chǎn)生的1-環(huán)戊基-4-亞硝基哌嗪均為亞硝胺雜質(zhì)。
本方法通過皖儀科技LC-MS TQ9200三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測利福平與利福噴丁中MNP與CPNP，其中，MNP與CPNP線性范圍均大于0-100 ng/mL，0.1 ng/mL信噪比均大于10，滿足實驗要求，完全適用于高效快速準(zhǔn)確地檢測利福平與利福噴丁中的MNP與CPNP含量。
關(guān)鍵詞：液質(zhì)聯(lián)用；亞硝胺雜質(zhì)；利福平、利福噴丁。
1.儀器配置
表1 儀器配置清單
儀器 | 數(shù)量 |
皖儀LC3600系列高效液相色譜 | 1 |
皖儀TQ9200系列三重四極桿質(zhì)譜儀 | 1 |
渦旋混勻器 | 1 |
離心機(jī) | 1 |
2.儀器方法
2.1 液相條件
色譜柱：phenomenex Kinetex F5 2.6 μm，3x100 mm
流動相：A相：甲醇
B相：水
流速：0.3 mL/min
柱溫：40 ℃
進(jìn)樣體積：5 μL
2.2 質(zhì)譜條件
本方法使用電噴霧離子源，離子源電壓為5500 V，脫溶劑氣流量為17000 mL/min，脫溶劑氣溫度為450 ℃，霧化氣流量為2000 mL/min，氣簾氣流量為8000 mL/min，氣簾氣溫度為150 ℃，碰撞氣流量為800 μL/min。
2.3 化合物參數(shù)
表2 質(zhì)譜化合物參數(shù)
化合物名稱 | 掃描模式 | 前體離子 | 產(chǎn)物離子 | DP（V） | CE（eV） | CXP（V） |
MNP | + | 130.2 | 100.2 | 48 | 12 | 11 |
58.1* | 48 | 22 | 11 | |||
CPNP | + | 184.3 | 154.3 | 30 | 12 | 11 |
98.3* | 30 | 18 | 11 |
注：帶*為定量離子
3.方法學(xué)驗證
3.1 實驗結(jié)果
9.5分鐘內(nèi)完成利福平與利福噴丁中MNP與CPNP的測定，化合物均有良好的峰形，無常見的峰形拖尾現(xiàn)象，化合物響應(yīng)良好，符合實驗測定需求。
圖1 實驗結(jié)果總圖
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線
精確配制100 μg/mL MNP與CPNP混標(biāo)，稀釋至0.2μg/mL，逐級稀釋為200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL。
表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍
化合物 | 線性方程 | R2 | 線性范圍( ng/mL) |
MNP | Y=125306.43*X+730.35 | 0.999 82 | 0-200 |
CPNP | Y=559701.56*X-13894.98 | 0.999 50 | 0-100 |
圖2 MNP標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖3 CPNP標(biāo)準(zhǔn)曲線
3.3 精密度
連續(xù)進(jìn)樣6針0.5 ng/mL、5 ng/mL、50 ng/mL分別檢測該線性在低中高不同濃度的重復(fù)性，RSD小于3%，符合要求。
表2 精密度數(shù)據(jù)結(jié)果
濃度( ng/mL) | MNP | CPNP |
RSD(%,n=6) | RSD(%,n=6) | |
0.5 | 2.364 | 2.423 |
5 | 2.893 | 1.425 |
50 | 2.904 | 0.932 |
圖4 MNP 6針重復(fù)性色譜圖 圖5 CPNP 6針重復(fù)性色譜圖
3.4 靈敏度
使用峰到峰方式計算0.1 ng/mL MNP信噪比為19.674，0.1 ng/mL CPNP信噪比為47.964，均大于10，符合要求。
表5 靈敏度數(shù)據(jù)結(jié)果
化合物 | 0.1 ng/mL信噪比 |
MNP | 19.674 |
CPNP | 47.964 |
圖6 0.1 ng/mL色譜圖
3.5 樣品檢測
取利福平與利福噴丁膠囊內(nèi)容物配置成樣品溶液，稀釋后進(jìn)液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析，實驗結(jié)果如下：
表6 樣品含量檢測結(jié)果
化合物 | 樣品量( ng/mL) | RSD(%,n=3) |
MNP | 0.052 | 6.480 |
CPNP | 0.137 | 2.120 |
圖7 利福平中的MNP色譜圖
圖8 利福噴丁中的CPNP色譜圖
在FDA公布的含有亞硝胺雜質(zhì)的藥物中，MNP與CPNP限值均為400 ng/day，其成人每日最大攝入量為300 mg。將利福平和利福噴丁處理完成的上清液進(jìn)液質(zhì)檢測以后發(fā)現(xiàn)利福平溶出液中含有MNP含量為0.052 ng/mL；利福噴丁溶出液中CPNP含量為0.137 ng/mL，而假設(shè)每天攝入300 mg藥物，則MNP攝入量為15.6 ng/day，CPNP攝入量為41.1 ng/day，均小于FDA規(guī)定的限值。
4.結(jié)論
經(jīng)過以上內(nèi)容的驗證，說明本方法適用于檢測利福平與利福噴丁中的MNP與CPNP，其中，MNP與CPNP線性范圍均大于0-100 ng/mL，0.1 ng/mL信噪比均大于10，滿足實驗要求，完全適用于高效快速準(zhǔn)確地檢測利福平與利福噴丁中的MNP與CPNP含量。
相關(guān)產(chǎn)品
如需下載完整解決方案，請?zhí)顚懸韵滦畔ⅰ?
