方案概述
前言：
硝基呋喃類抗生素曾以其卓越的廣譜抗菌活性和相對低廉的成本，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，作為促生長添加劑和治療多種動物細菌性及原蟲性感染疾?。ㄈ缒c道感染、球蟲?。┑闹匾幬?。其核心作用機制在于其代謝產(chǎn)生的活性衍生物能不可逆地抑制細菌乙酰輔酶A等多種酶系統(tǒng)，強力干擾微生物的糖代謝過程，最終導(dǎo)致病原體死亡。然而，由于硝基呋喃類藥物及其代謝產(chǎn)物被證實具有潛在的“三致”作用（致癌、致畸、致突變）以及遺傳毒性，對消費者健康構(gòu)成嚴重威脅，并可能引發(fā)過敏反應(yīng),已全面禁止其在食用動物生產(chǎn)中的任何用途。硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)代謝迅速，原形藥物在可食用組織中難以檢出，但其代謝產(chǎn)物卻能與組織大分子（如蛋白質(zhì)）形成穩(wěn)定的共價結(jié)合物（鍵合殘留），從而長期蓄積于動物肌肉、肝臟、腎臟及蛋、奶等可食性產(chǎn)品中。因此直接檢測這四種關(guān)鍵代謝物成為監(jiān)控硝基呋喃類藥物非法使用、評估食品中該類殘留風(fēng)險的核心手段和唯一有效途徑。建立高靈敏、高選擇性的硝基呋喃代謝物檢測技術(shù)對于保障食品安全、維護消費者健康權(quán)益、確保動物源性產(chǎn)品順利出口以及有效打擊非法用藥行為具有至關(guān)重要的意義。
我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 31650-2019食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定硝基呋喃類抗生素作為食品中禁止檢出藥物；同時食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 21311-2007 動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定了4種硝基呋喃類代謝物液質(zhì)檢測方法。本應(yīng)用方案成功驗證了皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足雞肉中4種硝基呋喃類代謝物殘留的檢測方法要求。
關(guān)鍵詞：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；硝基呋喃類代謝物；食品安全；獸藥殘留
1.儀器設(shè)備及試劑
1.1液相串聯(lián)質(zhì)譜配置清單
表1 儀器配置清單表
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序號 |
名稱 |
數(shù)量 |
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1 |
LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng) |
1臺 |
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2 |
P3600B 二元高壓恒流泵 |
1臺 |
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3 |
CT3600 柱溫箱 |
1臺 |
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4 |
AS3600 超高效自動進樣器 |
1臺 |
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5 |
SmartLab CDS 2.0色譜使用工作站 |
1套 |
1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單
表2 試劑及標(biāo)品清單表
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序列 |
試劑及標(biāo)準(zhǔn)品 |
純度 |
|
1 |
甲醇 |
LC-MS級 |
|
2 |
乙腈 |
LC-MS級 |
|
3 |
甲酸 |
LC-MS級 |
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4 |
鹽酸 |
分析純 |
|
5 |
乙酸乙酯 |
分析純 |
|
6 |
乙酸銨 |
分析純 |
|
7 |
2-硝基苯甲醛 |
分析純 |
|
8 |
磷酸氫二鉀 |
分析純 |
|
9 |
二甲亞砜 |
分析純 |
|
10 |
氟苯尼考胺 |
99% |
|
11 |
3-氨基-2-惡唑酮（AOZ） |
99% |
|
12 |
AOZ-D4 |
99% |
|
13 |
5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ） |
99% |
|
14 |
AMOZ-D5 |
99% |
|
15 |
1-氨基-乙內(nèi)酰脲（AHD） |
99% |
|
16 |
AHD-13C3 |
99% |
|
17 |
氨基脲（SEM） |
99% |
|
18 |
SEM-13C,15N2 |
99% |
1.3實驗材料及輔助設(shè)備
超聲波清洗機；
渦旋混合器；
水浴氮吹儀；
水浴恒溫振蕩器；
高速離心機。
2.實驗方法
2.1溶液配制
2.1.1 0.2 mol/L 鹽酸溶液：取鹽酸1.7 mL，加水稀釋到100 mL。
2.1.2 2 mol/L 氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉80 g，用水溶解并稀釋到1000 mL，混勻。
2.1.3 0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液：取2-硝基苯甲醛 1.5 g，用甲醇溶解并稀釋至100 mL，混勻。
2.1.4 0.3 mol/L 磷酸鉀溶液：取三水磷酸鉀39.95 g，用水溶解并稀釋至500 mL，混勻。
2.1.5 乙腈飽和正己烷溶液：取適量的正己烷，加入過量的正己烷溶液，充分震蕩分層，取上層正己烷溶液。
2.2樣本前處理
2.2.1樣本水解與衍生
稱取試料2g(準(zhǔn)確至±0.01g)，于50 mL聚丙烯離心管中，加10 mL 50%甲醇水溶液，渦旋振蕩10 min，4000 rpm 離心10 min，棄去上清液。準(zhǔn)確加混合內(nèi)標(biāo)工作液100 µL，渦旋1 min，加鹽酸溶液10 mL、2-硝基苯甲醛溶液100 µL，渦旋混合1 min，置于水浴恒溫振蕩器中，37℃避光振蕩16 h。
2.2.2樣本凈化
取出離心管冷卻至室溫，加入2 mL0.3mol/L磷酸鉀溶液，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.4，加乙酸乙酯15 mL，渦旋振蕩1 min，6000 rpm 離心5 min，收集乙酸乙酯層至15 mL聚丙烯離心管中，40℃氮氣吹干。加0.1%甲酸水溶液1 mL溶解殘留物，再用3 mL乙腈飽和正己烷除脂，下層水相過0.22 µm有機濾膜，待進樣。
2.2.3基質(zhì)標(biāo)線配制
稱取5份陰性試料2g(準(zhǔn)確至±0.01g)，于50 mL聚丙烯離心管中，加10 mL 50%甲醇水溶液，渦旋振蕩10 min，4000 rpm 離心10 min，棄去上清液。殘留物中準(zhǔn)確加入適量標(biāo)準(zhǔn)品，最終配制濃度分別為0.5、1、2、5、10、20ng/mL，余下步驟如上述樣本處理方法相同。
2.3實驗條件
2.3.1液相方法條件
色譜柱：C18 1.7μm 2.1x50mm
流動相：A相：甲醇；B相：2 mM乙酸銨水
流速：0.3 mL/min
柱溫：35 ℃
進樣體積：5 µL
2.3.2質(zhì)譜方法條件
表3 質(zhì)譜離子源參數(shù)
|
離子源 |
參數(shù) |
|
離子源電壓 |
ESI+5000 V |
|
脫溶劑氣流速 |
15000 mL/min |
|
霧化氣流速 |
2000 mL/min |
|
氣簾氣流速 |
5000 mL/min |
|
碰撞氣流速 |
800 μL/min |
|
脫溶劑氣溫度 |
500 ℃ |
|
氣簾氣溫度 |
150 ℃ |
3實驗結(jié)果
3.1標(biāo)準(zhǔn)品譜圖
7分鐘內(nèi)完成4種硝基呋喃類抗生素代謝物及內(nèi)標(biāo)的測定，各峰均有良好的峰形，無峰形拖尾現(xiàn)象，各化合物響應(yīng)良好，符合實驗測定需求。
圖1 4種硝基呋喃類抗生素代謝物及內(nèi)標(biāo)色譜圖（0.5 ng/mL）
3.2線性范圍
取適量硝基呋喃類代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品水解、衍生、凈化步驟前處理制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用同位素內(nèi)標(biāo)法進行定量分析，線性范圍為0.5-20 ng/mL，線性檢測結(jié)果與已知濃度的偏差小于最大允許偏差，R²范圍在0.9984~0.9999之間，均大于0.99，各組分線性關(guān)系良好。
表4各化合物線性范圍表
|
化合物 |
線性范圍 |
回歸方程 |
線性相關(guān)系數(shù)R2 |
|
AOZ |
0.5-20 ng/mL |
Y=0.250X+0.001 |
0.9984 |
|
AMOZ |
0.5-20 ng/mL |
Y=0.255X+0.030 |
0.9999 |
|
AHD |
0.5-20 ng/mL |
Y=0.238X-0.010 |
0.9996 |
|
SEM |
0.5-20 ng/mL |
Y=0.255X+0.014 |
0.9998 |
圖2 4種化合物線性結(jié)果
3.3檢測限與定量限
食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21311-2007中規(guī)定本方法中4種硝基呋喃類代謝物的檢測限為0.5 µg/kg，定量限為1 µg/kg。本方法中各化合物在檢測限與定量限規(guī)定濃度下信噪比大于3和10，符合國標(biāo)中靈敏度要求。
表5 各化合物檢測限與定量限
|
化合物 |
信噪比（S/N） |
|
|
檢測限 |
定量限 |
|
|
AOZ |
54.99 |
126.00 |
|
AMOZ |
31.35 |
101.98 |
|
AHD |
47.08 |
109.69 |
|
SEM |
12.00 |
40.82 |
圖3 4種化合物檢測限與定量限色譜圖
3.4精密度測試
取低中高三種濃度硝基呋喃類代謝物混合溶液，連續(xù)進樣6針比較保留時間與峰面積偏差，結(jié)果如下表所示，所有硝基呋喃類代謝物保留時間偏差均小于1%，峰面積偏差均小于5%，符合國標(biāo)的RSD≤15%的精密度要求。
表6 各化合物精密度測試
|
化合物 |
濃度(ng/mL) |
保留時間偏差RSD(%，n=6) |
峰面積偏差 RSD(%，n=6) |
|
AHD |
1 |
0.24 |
4.78 |
|
2 |
0.44 |
3.46 |
|
|
5 |
0.39 |
2.45 |
|
|
AOZ |
1 |
0.19 |
2.42 |
|
2 |
0.36 |
3.04 |
|
|
5 |
0.55 |
2.50 |
|
|
SEM |
1 |
0.20 |
2.58 |
|
2 |
0.44 |
3.65 |
|
|
5 |
0.46 |
2.66 |
|
|
AMOZ |
1 |
0.14 |
2.91 |
|
2 |
0.49 |
2.03 |
|
|
5 |
0.46 |
2.63 |
圖4 4種硝基呋喃類代謝物精密度色譜圖
3.5基質(zhì)加標(biāo)回收率測試
采用加標(biāo)回收試驗評估該檢測項目的正確度：測定各檢測指標(biāo)的濃度，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品按不同比例加到空白基質(zhì)樣品中進行前處理，制作高、中、低三個不同濃度的基質(zhì)加標(biāo)樣品。每個濃度的加標(biāo)樣品獨立測定6次，通過檢測加標(biāo)前后基質(zhì)中的濃度，計算回收率，評估該項目的準(zhǔn)確度。結(jié)果如下所示：雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率在88.32-105.05%之間，CV在5%以內(nèi)，準(zhǔn)確度符合方法要求。
表7 雞肉基質(zhì)中各化合物加標(biāo)回收率
|
化合物 |
加標(biāo)量(ng/mL) |
測得量（ng/mL） |
平均回收率 （%，n=6） |
CV（%，n=6） |
|
AHD |
2.00 |
1.98 |
99.13 |
2.52 |
|
4.00 |
4.20 |
105.05 |
2.50 |
|
|
10.00 |
10.39 |
103.92 |
3.38 |
|
|
AOZ |
2.00 |
1.77 |
88.32 |
3.72 |
|
4.00 |
3.70 |
92.57 |
4.32 |
|
|
10.00 |
9.59 |
95.86 |
2.59 |
|
|
SEM |
2.00 |
1.98 |
98.96 |
3.95 |
|
4.00 |
4.08 |
102.06 |
4.42 |
|
|
10.00 |
10.47 |
104.68 |
0.89 |
|
|
AMOZ |
2.00 |
1.87 |
93.48 |
2.91 |
|
4.00 |
4.06 |
101.45 |
1.27 |
|
|
10.00 |
10.40 |
104.00 |
1.04 |
3.6樣品測試
公司附近超市隨機購買雞胸肉樣品，經(jīng)上述樣品前處理方法提取、凈化，樣品上機測試，4種硝基呋喃類代謝物對應(yīng)保留時間均無色譜峰測出，其他色譜峰為衍生化后雜質(zhì)，結(jié)果表明雞胸肉樣品4種硝基呋喃類代謝物均未檢出。
圖5 超市雞胸肉樣品中4種硝基呋喃類代謝物化合物色譜圖
4結(jié)論
本方法使用皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，進行動物源食品中硝基呋喃類代謝物含量的測定。由數(shù)據(jù)可得該方法的各色譜峰峰形良好、無拖尾，靈敏度符合國標(biāo)要求，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，連續(xù)6針各化合物保留時間偏差在1%以內(nèi)，峰面積偏差均在5%以內(nèi)，精密度良好；雞肉基質(zhì)加標(biāo)回收率在88.3-105.1% 之間，CV在5%以內(nèi)；超市隨機購買雞胸肉樣品，上機測試4種硝基呋喃類代謝物均未檢出。說明了該方法配備皖儀科技液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足對待測樣本的常規(guī)性定性定量檢測需求。
相關(guān)產(chǎn)品
如需下載完整解決方案，請?zhí)顚懸韵滦畔ⅰ?
