方案概述

前言：

紅霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由紅色鏈霉菌（Streptomyces erythreus）發(fā)酵產(chǎn)生，主要通過抑制細菌蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抗菌作用。其作用機制是與細菌核糖體50S亞基結(jié)合，阻斷肽酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，從而抑制肽鏈延伸，尤其對革蘭氏陽性菌（如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌）和部分革蘭氏陰性菌（如流感嗜血桿菌）以及非典型病原體（如支原體、衣原體）有效。紅霉素的生產(chǎn)主要依賴生物發(fā)酵技術，包括菌種選育、種子培養(yǎng)、發(fā)酵罐大規(guī)模培養(yǎng)、提取和純化等步驟。發(fā)酵完成后，通過有機溶劑（如乙酸丁酯）萃取、結(jié)晶或離子交換樹脂分離提純，最終制成臨床適用的鹽類（如紅霉素琥珀酸乙酯）。然而，紅霉素生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量菌渣（發(fā)酵殘渣），其中可能殘留抗生素、菌體蛋白及代謝產(chǎn)物。若處理不當，菌渣可能通過環(huán)境排放或作為飼料添加劑進入生態(tài)鏈，導致多重危害：殘留紅霉素可能促進土壤和水體中耐藥基因的傳播，破壞微生物群落平衡；通過食物鏈富集，誘發(fā)動物或人體內(nèi)耐藥菌株的出現(xiàn)，削弱抗生素療效；菌渣中未被充分利用的有機質(zhì)可能造成污染。因此，嚴格監(jiān)管菌渣殘留是控制紅霉素生產(chǎn)污染的關鍵措施。

本次實驗參考《T/PIAC 00003—2021 中國化學制藥工業(yè)協(xié)會團體標準抗生素菌渣及有機肥基料、作物、環(huán)境介質(zhì)中紅霉素檢測方法》，采用皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進行檢測菌渣中紅霉素的含量。實驗結(jié)果顯示，系統(tǒng)適用性測試，峰型良好，線性良好，滿足實驗要求。紅霉素標準工作溶液保留時間以及峰面積重復性均在1%以下，重復性較好。靈敏度溶液測試紅霉素0.2ng/mL、0.5ng/mL濃度處主峰信噪比遠大于3和10，滿足實驗要求。試樣測試結(jié)果均正常。以上數(shù)據(jù)均滿足標準方法對于儀器的要求。

關鍵詞：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；紅霉素；抗生素菌渣；環(huán)境污染。

1.儀器設備及試劑

1.1 液相串聯(lián)質(zhì)譜配置清單

表1 儀器配置清單表

序號	名稱	數(shù)量
1	LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)	1臺
2	P3600B 二元高壓恒流泵	1臺
3	CT3600 柱溫箱	1臺
4	AS3600 超高效自動進樣器	1臺
5	SmartLab CDS 2.0色譜工作站	1套

1.2 試劑及標準品清單

表2 試劑及標品清單表

序列	試劑及標準品	純度
1	甲醇	LC-MS級
2	乙腈	LC-MS級
3	甲酸	LC-MS級
4	紅霉素A	98.5%

1.3 實驗材料及輔助設備

超聲波清洗機；

渦旋混合器；

高速離心機。

2.實驗方法

2.1 樣本前處理

稱取樣品0.5 g（精確至0.001 g），于具塞玻璃管中，加入50 mL 乙腈，渦旋振蕩1 min，使樣品混勻，超聲輔助提取20 min，然后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，以4000 rpm離心10 min，取適量上清液過0.22 μm濾膜，棄去至少1 mL初濾液后，將濾液裝入棕色液相小瓶中，待測。

2.2 實驗條件

2.2.1 液相方法條件

色譜柱：C18 1.7μm 2.1x50mm；

流動相：A相：乙腈；B相：0.1%甲酸水溶液；

流速：0.3 mL/min；

柱溫：30 ℃；

進樣體積：2 µL。

2.2.2 質(zhì)譜方法條件

表3 質(zhì)譜離子源參數(shù)

離子源	參數(shù)
離子源電壓	ESI+5500 V
脫溶劑氣流速	15000 mL/min
霧化氣流速	2000 mL/min
氣簾氣流速	5000 mL/min
碰撞氣流速	800 μL/min
脫溶劑氣溫度	450 ℃
氣簾氣溫度	150 ℃

3.實驗結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性測試

系統(tǒng)適用性測試顯示，目標峰峰型良好，周圍無雜峰干擾，滿足實驗要求。

圖1 紅霉素A標準工作液測試色譜圖（0.5 ng/mL）

3.2 線性范圍

取紅霉素A標準溶液，使用中間濃度工作液逐步配制標準曲線，紅霉素A線性范圍為0.5-500 ng/mL，R²大于0.99，線性關系良好。

表4 紅霉素A線性范圍表

化合物	線性范圍	回歸方程	線性相關系數(shù)R²
紅霉素A	0.5-500 ng/mL	y=18696.37x+9744.61	0.9981

圖2 紅霉素A標準曲線圖

3.3 檢測限與定量限

本方法中以0.2 ng/mL、0.5 ng/mL分別為紅霉素A標準溶液的檢測限與定量限，其信噪比分別為110.02、292.20，遠大于3和10，滿足實驗靈敏度要求。

圖3 紅霉素A檢測限與定量限離子流圖

3.4 精密度測試

連續(xù)進樣7次紅霉素A溶液，結(jié)果如下圖所示，紅霉素A保留時間偏差為0.19%，峰面積偏差為0.96%，均小于5%，滿足實驗要求。

圖4 紅霉素A試樣連續(xù)進樣7針精密度色譜圖

3.5 樣品測試

按照上述前處理方法測試，固體試樣中目標峰峰面積為7.4E6，通過外標法計算可知，試樣溶液中紅霉素A含量為400 ng/mL。

圖5 紅霉素A樣品測試色譜圖

4.結(jié)論

本方法使用皖儀科技LCMS-TQ9200液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，進行抗生素菌渣中紅霉素A含量的測定。由數(shù)據(jù)可得該方法的各色譜峰峰形良好、無拖尾，靈敏度符合實驗要求，線性相關系數(shù)大于0.99，連續(xù)7針各化合物保留時間以及峰面積偏差均在1%以內(nèi)，精密度良好；樣品無雜峰干擾，樣品含量為400 ng/mL。說明了該方法配備皖儀科技液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)滿足對待測樣本的常規(guī)性定性定量檢測需求。

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